Séquençage profond de bibliothèques de phages utilisant des plateformes Illumina

L'efficacité du dépistage de bibliothèques de phages affichés Les bibliothèques (par exemple, scFv, Fab ou nanobodies) dépendent crucialement d'une évaluation approfondie de la qualité de la bibliothèque. Le séquençage profond via la plateforme Illumina est devenu la méthodologie définitive pour une telle évaluation. Cette technologie englobe l'ensemble du flux de travail, des stratégies de construction de bibliothèques et de l'optimisation des paramètres de séquençage à l'analyse complète des données.

Étapes clés et optimisation technique dans la construction de bibliothèques

1. Intégration de l'amplification et de l'adaptateur

• Flux de travail : Extraction de l'ADN de phage → Amplification par PCR de l'insert → Ligation des adaptateurs Illumina → Sélection de taille et purification
• Conception de primers : Les primers spécifiques au vecteur amplifient les régions d'insertion, encadrées par des linkers de séquençage P5/P7 (par exemple, *5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-[Index]-TCGTCGGCAGCGTC-3′*).
• Atténuation des biais : Limitez les cycles de PCR à ≤18 en utilisant des enzymes à haute fidélité (par exemple, Q5 HF) pour prévenir le biais de séquence induit par l'amplification.

2. Stratégie de double indexation

• Configuration de l'index :

• Capacité : 384 échantillons par exécution activés par des paires d'index uniques, idéaux pour le contrôle qualité de bibliothèques à grande échelle.

3. Sélection de la taille des fragments

• Paramètres :
• Plage : 400–800 pb (couvre >90 % des séquences scFv)
• Purification : Les billes AMPure XP (0,8× volume) éliminent efficacement les dimères d'amorces.

Méthodologies améliorées

1. Fragmentation et ligation alternatives

• Innovations :
  • Fragmentation par ultrasons : le Covaris M220 (50W de puissance de crête, 10 % de rapport cyclique) remplace la digestion enzymatique, éliminant ainsi le biais de séquence.
• Construction de bibliothèques sans PCR :
  • Avantage : Aucun biais d'amplification (critique pour un contenu élevé en GC).
  • Application : Bibliothèques >10¹² complexité.
  • Optimisation de la ligation :
    • La ligase NEB Ultra II (22°C, 30 min) avec un excès de 15× en moles de lien atteint une efficacité de plus de 95 %.

2. Conception à double index améliorée

• Améliorations :

• Validation : Analyse NovaSeq 6000 de 48 bibliothèques (3 réplicats chacune) a réduit les taux de duplication corrigés par code-barres moléculaire de 35 % à <1 %.

3. Sélection de taille automatisée et contrôle qualité

• Systèmes :
  • Tri des tailles : BluePippin™ (Sage Science) isole des fragments de 350 ± 50 pb (optimal pour scFv) avec >90 % de récupération (contre 60 % par électrophorèse sur gel).
• Métriques de qualité :
  • Concentration de fragment ≥2 nM (préventif contre la perte de clusters).
  • DV₂₀₀ ≥85 % (assure l'intégrité des fragments).

Couverture de séquence des lectures de séquençage Illumina et nanopore de l'AlkB (Plessers S et al., 2021)

Optimisation des paramètres de séquençage Illumina

1. Sélection de la plateforme et configuration de la longueur de lecture

• Stratégies Améliorées :
  • Résolution complète CDR3 : NovaSeq™ 2 × 300 pb couvre les jonctions VH-VL (>400 pb)
  • Cartographie des points chauds de mutation : MiSeq™ 2 × 250 pb (600 cycles) permet une résolution à base unique.
  • Bibliothèques méga-corrigées : HiSeq X Ten™ 2 × 150 pb + code-barres moléculaire atteint <0,01 % d'erreur moléculaire brute.
• Métrique de précision de la longueur de lecture :
  • Longueur de lecture effective = (Longueur Phred Q30 / Longueur totale de lecture) × 100%
  • NovaSeq 6000 : lectures Q30 de 220 pb en mode 250 pb (utilisation de 88 %)

2. Calcul de la profondeur de séquençage

Modèle Standard :

• Profondeur requise = Complexité de la bibliothèque × 100
• Exemple : 10⁹ bibliothèques → 10¹¹ lectures (100 Go de données)

Formule de Couverture Dynamique :

• Calcul computation étape par étape :
  • Exigence de couverture de base : Profondeur effective (lectures) = Taille de la bibliothèque × 100
  • Ajustement de sécurité clinique : Si la taille de la bibliothèque > 10¹¹ : Profondeur effective × Facteur de sécurité (par défaut : 1,5)
  • Conversion d'unités : Résultat (Gb) = Arrondi(Profondeur effective ÷ 10⁹, 2)
• Représentation mathématique :
  Données requises (Go) = Taille de la bibliothèque × 100 × 1,5 × 10^−9 si la taille de la bibliothèque > 10^11
  Taille de la bibliothèque × 100 × 10⁻⁹ sinon
  (Round à deux décimales)
• Exemple de calcul :
  • Pour une taille de bibliothèque = 10¹⁰ :
    • Base de référence : 10¹⁰ × 100 = 10¹² lectures
    • Ajustement clinique : Non déclenché (≤10¹¹)
    • Conversion : 10¹² ÷ 10⁹ = 100,00 Go
    • (Remarque : La sortie du code original de 150,0 Go semble incohérente avec la formule)
• Note de qualité clinique : couverture ≥500× recommandée pour les applications diagnostiques.

Différence en pourcentage de la fréquence positionnelle des acides aminés entre des échantillons avec des profondeurs de séquençage différentes (Sloth AB et al., 2023)

3. Contrôles PhiX et Spike-In personnalisés

• Optimisation PhiX :

• Fonction : Compense le déséquilibre du signal de fluorescence
• Avantages des Spike-In personnalisés :
  • Séquences mutantes synthétisées (par exemple, variantes CDR-H3)
  • Permet une surveillance de la sensibilité en temps réel (>0,05 % de détection de variantes à basse fréquence)

Pipeline d'analyse des données pour la détection de mutations

1. Contrôle de la qualité des données brutes

• Évaluation initiale :
• Outils : FastQC + MultiQC pour un rapport intégré
• Indicateurs clés :
  • Score Q30 >85%
  • Écart de contenu en GC <±5% par rapport aux valeurs théoriques

Processus automatisé de contrôle de la qualité des données brutes

• Mise en œuvre de l'outil : Les données de séquençage appariées brutes (raw_R1.fq, raw_R2.fq) ont subi un traitement de qualité automatisé à l'aide de fastp avec des paramètres optimisés :
• Étapes clés du traitement :
  • Rognage d'adaptateur : séquence d'adaptateur Illumina AGATCGGAAGAGC supprimée des deux extrémités des lectures.
  • Filtrage de qualité :
    • Régions de faible qualité de 3' coupées à l'aide d'une approche par fenêtre glissante.
    • Retenu uniquement les bases avec un score de qualité Phred ≥30
  • Sélection de la longueur : Lectures rejetées <100 pb après le trimming pour garantir une analyse en aval fiable.
  • Lectures de haute qualité traitées enregistrées sous clean_R1.fq et clean_R2.fq

Spécifications techniques

• Raison d'être du contrôle qualité :
  • Le retrait de l'adaptateur empêche les erreurs d'assemblage lors de la jonction des séquences.
  • Le filtrage Q30 réduit les appels de variantes faussement positifs dans l'analyse des mutations.
  • Le seuil de longueur élimine les fragments courts non informatifs.

Ce prétraitement optimisé garantit l'intégrité des données pour les étapes d'assemblage et d'annotation suivantes.

• Indicateurs QC avancés :
  • Le ratio de duplication du code-barres post-moléculaire >30 % déclenche le re-séquençage.
  • Pente de qualité de lecture : déclin du score Q <5% au-delà de 150 pb

2. Flux de travail d'assemblage de séquences et de quantification d'abondance

Assemblage de séquences en paires

• Outil : PANDAseq (v2.11)
• Lectures brutes avant/arrière (raw_R1.fq, raw_R2.fq)
• Paramètres :
  • Algorithme de détection de chevauchement par défaut
  • Fusion de lectures basée sur la qualité
• Gestion de la sortie :
  • Séquences assemblées avec succès → assembled.fasta
  • Lectures non assemblées → unassembled.fq
• Fonction clé : Reconstruit des séquences complètes à partir de fragments appariés chevauchants.

Dédoublonnage de séquences et profilage d'abondance

• Outil : USEARCH (v11.0)
• Séquences assemblées (assembled.fasta)
• Paramètres critiques :
  • -fastx_uniques : Identifie les variants de séquences uniques
  • -sizeout : Enregistre les comptes d'abondance dans les en-têtes FASTA
  • -fastaout : Sortie des séquences dédupliquées
• Sortie :
  • Séquences uniques avec annotations d'abondance → uniques.fa
  • >SEQ123;taille=4500 (indique 4 500 lectures identiques)

Notes de mise en œuvre technique

• Application en aval :
  Le fichier uniques.fa résultant sert d'entrée pour :
  • Annotation de la région CDR (via ANARCI)
  • Analyse de la fréquence des mutations
  • Calculs de diversité des bibliothèques
  • Études d'expansion clonale

Ce flux de travail garantit une reconstruction précise des séquences d'anticorps tout en préservant les informations quantitatives essentielles pour l'analyse du répertoire immunitaire.

• Optimisation haute performance : lectures propres → assemblage de chevauchement FLASH2 → clustering CD-HIT-EST (97 % de similarité) → tri par taille USEARCH → annotation de domaine IgBLAST
• Parallélisation :
  • Mode IgBATCH : 100 000 séquences/nœud
  • Intégration du référentiel structurel IMGT/LIS dans une base de données personnalisée

3. Résolution de domaine fonctionnel et analyse de mutation

• Identification CDR : outil ANARCI avec numérotation Kabat (Entrée : uniques.fa → Sortie : cdr_annot.csv)
• Détection de mutations pilotée par l'IA :

• Protocole de vérification des mutations : Variants à haute fréquence (>5%) → Construction de gènes synthétiques → Validation SPR (correlation des valeurs KD)

Métriques d'évaluation de la qualité des bibliothèques

5. Voies de diagnostic automatisées

Résolution de l'anomalie de taille de fragment

• Problème : Distribution de taille anormale dans l'analyse des fragments
• Action corrective :
  • Valider les paramètres de fragmentation par ultrasons (puissance de crête, cycle de service)
  • Recalibrer la puce microfluidique Bioanalyzer
  • Raison technique : Assure une plage de fragments cohérente de 350 à 800 pb, essentielle pour les bibliothèques scFv.

Gestion des alertes à faible complexité

• Problème : Taux de duplication >30 % après correction du code-barres moléculaire
• Protocole correctif :
  • Répétez la préparation de la bibliothèque avec des réactifs frais.
  • Mettre en œuvre une PCR contrôlée par biais :
    • ≤18 cycles d'amplification
    • Polymérase haute fidélité (Q5 HF)
    • Mélange de nucléotides équilibré
    • Focus sur la prévention : Éliminer le biais induit par la PCR dans les régions à faible diversité

Restauration de l'intégrité CDR3

• Problème : >10 % de troncature dans les régions déterminantes de la complémentarité
• Stratégie d'optimisation :
  • Reconcevoir le cadre d'utilisation des codons :
    • Évitez les tARN rares (par exemple, les codons d'arginine AGG/AGA)
    • Optimiser la teneur en GC (40-60%)
    • Incorporez des séquences Kozak.
  • Valider avec une simulation de repliement in silico
    • Objectif : Maintenir l'intégrité structurelle des domaines de liaison aux antigènes.
  • Mise en œuvre du flux de travail de diagnostic
  • Lors de la réception d'un drapeau de qualité dans le séquençage de la bibliothèque d'anticorps, le système initie un protocole de triage avec trois voies d'investigation parallèles. Si un décalage de fragment est détecté, les techniciens vérifient d'abord les paramètres d'ultrasons Covaris (50W de puissance de pointe, 10% de cycle de service) et relancent l'analyse Bioanalyzer. Pour les alertes de faible complexité, le protocole nécessite une nouvelle préparation de bibliothèque avec des contrôles de biais PCR, y compris une limitation du cycle (≤18 cycles) et des enzymes de haute fidélité. Lorsque la troncation CDR3 dépasse 10%, la solution implique une optimisation des codons suivie d'une validation de repliement protéique in silico. Chaque voie contient des interventions techniques spécifiques qui alimentent la réévaluation de la qualité jusqu'à ce que les problèmes soient résolus.
  • Métriques de validation diagnostique :
    • Résolution de changement de taille : Bioanalyzer DV200 >85%
    • Amélioration de la complexité : Taux de duplication après correction <15%
    • Récupération CDR3 : Séquences complètes >95%

Cette approche diagnostique par paliers permet un dépannage rapide des échecs de préparation de bibliothèques NGS tout en maintenant l'intégrité du pipeline de découverte d'anticorps.

Aperçu de la stratégie pour générer des anticorps à partir de bibliothèques de scFv séquencées en profondeur (Nannini F et al., 2021)

Solutions révolutionnaires pour les principaux défis techniques

1. Élimination de l'interférence des mutations synonymes

• Stratégie principale : Établir des bases de fréquence des codons en utilisant des bases de données de référence.
  • Référence principale : Base de données sur l'utilisation des codons de Kazusa
  • Métrique de déviation :
    Indice de Déviation de Mutation = Théorique / Fréquence Observée
  • Seuil : Des écarts >2,0 indiquent des mutations non aléatoires.
• Filtre de bioinformatique amélioré :

2. Méthodologie de filtrage de la déviation d'utilisation des codons

• Objectif de l'algorithme : Identifier les mutations synonymes non aléatoires en comparant les fréquences de codons observées aux valeurs de référence spécifiques à l'espèce.
• Procédure de calcul :
  • Chargement des données de référence : Importer les fréquences de codons attendues à partir de la base de données Kazusa E. coli (e_coli_kazusa.csv)
  • Calcul de l'Indice de Déviation :
    Pour chaque mutation : Indice de Déviation (ID) = Fréquence Attendue / Fréquence Observée​
  • Dépistage de mutations significatives : Conserver les variantes où DI > seuil de 2,0
• Raison biologique :
  • Les mutations synonymes reflètent généralement une dérive génétique aléatoire.
  • DI > 2,0 indique une pression de sélection fonctionnelle potentielle.
  • Filtre efficacement les variations neutres des mutations améliorant l'affinité.
• Paramètres clés :

• DataFrame contenant uniquement les mutations avec DI > 2,0, prêt pour l'analyse de maturation d'affinité en aval.

Ce filtre computationnel améliore considérablement le rapport signal/bruit dans les études d'optimisation des anticorps en excluant les changements synonymes aléatoires tout en préservant les mutations fonctionnellement pertinentes.

Cas d'application : Considérations clés pour la construction de bibliothèques de phages par NGS

1. Matériaux expérimentaux

• Types de bibliothèques :
  • Ph.D.-7 : Heptapeptide linéaire (A-X7-GGGS)
  • Ph.D.-12 : Dodécapeptide linéaire (A-X12-GGGS)
  • Ph.D.-C7C : Heptapeptide cyclique contraint (AC-X7-CGGGS)
• Hôte bactérien : Escherichia coli ER2738
• Plateforme de séquençage : Illumina MiSeq (mode à extrémité unique)

2. Préparation de la bibliothèque NGS

• Amplification PCR :
  • Amorces : Séquences d'adaptateurs Illumina incorporées
    • Transcription: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTTCCTTTAGTGGTACCTTCTCTATTCTC*
    • 5'-C*TTTCAACAAAGTTCATGGGATCGATCTCGTAGCCGTCCTGTCGCTGAACTTGC*
  • Thermocyclage : Dénaturation initiale à 98°C pendant 30 secondes ; 25 cycles de [98°C pendant 20 secondes → 60°C pendant 30 secondes → 72°C pendant 20 secondes]
• Purification : Kit de purification PCR QIAquick

3. Innovations en analyse de données

• Pipeline de script personnalisé :
  • Fonction MATLAB : Séquence brute traduite en acides aminés, peptides invalides filtrés (contenant le codon stop '*').
  • Script Python 1 : Séquences de contaminants interbibliothèques éliminées.
  • Script Python 2 : Correction des artefacts de mauvaise classification des chevauchements de lectures dans les bibliothèques Ph.D.-7 et Ph.D.-12.
  • Script Python 3 : Identification des contaminants de phages de type sauvage (clones WT).
• Algorithme du Facteur d'Enrichissement (EF) :
  • EF = (Fréquence_actuelle / Fréquence_précédente)
  • Seules les clones présentant un EF > 1 (indiquant une dominance de propagation) ont été soumis à une analyse plus approfondie.

4. Expérience de contrôle non compétitive

• Propagation indépendante : Chaque bibliothèque a infecté ER2738 séparément.
• Titration : Comptage des plaques sur des plaques LB/Tet/X-gal à 0, 150 et 270 minutes.

5. Principales conclusions et implications

• La conformation des peptides impacte la fitness de propagation :
  • Environnement concurrentiel : Ph.D.-7 (court linéaire) > Ph.D.-12 > Ph.D.-C7C (cyclique).
  • Environnement non compétitif : le Ph.D.-C7C a proliféré le plus rapidement, indiquant que la dynamique des populations modifie de manière significative la fitness des clones.
• Avantages techniques de l'NGS démontrés :
  • Quantification précise des variations de proportion de la bibliothèque (par exemple, Ph.D.-7 est passé de 9 % à 57,1 % à t=150 min).
  • Détection des niveaux de contamination par des clones WT.
  • Identification de clones à haut EF portant des mutants à prolifération rapide (par exemple, au sein de Ph.D.-C7C).
• Considération expérimentale critique :
  • Biais de sélection de bibliothèque hybride : La dominance des courtes peptides linéaires peut masquer les ligands cycliques à haute affinité.
  • Stratégies d'atténuation : Mettre en œuvre une amplification par étapes (propagation indépendante initiale suivie d'un mélange) ou appliquer des facteurs de correction de biais de propagation.

6. Avancées techniques

• Étude pionnière : Première analyse NGS de la propagation concurrentielle à travers des bibliothèques de peptides multi-conformationnels, révélant l'impact de la dynamique des populations sur les résultats de criblage.
• Ressources Open-Source : Scripts d'analyse MATLAB/Python fournis (voir le matériel complémentaire).
• Innovation analytique : l'algorithme EF surmonte les limitations de la dépendance à l'abondance absolue traditionnelle.
• Directives de conception expérimentale : Les futurs dépistages de bibliothèques hybrides devraient intégrer :
  • Compensation de propagation : par exemple, facteurs de correction spécifiques à la bibliothèque.
  • Surveillance activée par NGS : suivi dynamique en temps réel de la croissance des clones (Kamstrup Sell D et al., 2023).

Diversité du pool de phages (Kamstrup Sell D et al., 2023)

Conclusion : Avancer vers l'ingénierie des anticorps 4.0

Séquençage profond les technologies, illustrées par des plateformes comme Illumina, ont subi une transformation fondamentale. Leur rôle a évolué au-delà de simples outils de contrôle de qualité pour devenir des moteurs indispensables à la conception d'anticorps de novo. Ce changement de paradigme repose sur des avancées clés :

• Franchir les barrières de débit : Des instruments tels que le NovaSeq™ x Plus atteignent des capacités de séquençage en un seul passage sans précédent (16 To), résolvant efficacement les complexités de bibliothèque jusqu'à 10¹³ clones.
• Écosystèmes d'analytique intelligente : des plateformes intégrées comme la suite BaseSpace™ accélèrent considérablement le traitement des données, transformant les données de séquençage brutes hors ligne en rapports cliniques exploitables en moins de 72 heures. De plus, le criblage CRISPR-Cas9 permet une vérification directe et synchrone liant la fonction phénotypique à la séquence génotypique.
• Technologies émergentes de pointe : Les développements futurs promettent d'immenses possibilités :
  • Séquençage in situ : Permettre la lecture directe des séquences de peptides affichées directement à partir de la surface des particules de phages.
  • Conception assistée par l'informatique quantique : Modélisation du vaste espace combinatoire (des milliards de conformations) au sein des boucles de la région déterminant la complémentarité (CDR) des anticorps pour une optimisation prédictive.

L'intégration profonde de bioinformatiqueL'intelligence artificielle et la synthèse automatisée catalysent désormais une révolution. Le séquençage profond des bibliothèques de phages se trouve à l'avant-garde, propulsant le développement de médicaments à base d'anticorps dans un cycle intelligent et itératif "Concevoir-Construire-Tester-Apprendre" (DBTL). Cela représente le paradigme central de l'Ingénierie des Anticorps 4.0.

Pour plus d'informations sur ce qu'est le séquençage des phages, voir "Qu'est-ce que le séquençage de phages ? Un guide complet pour les chercheurs..

D'autres méthodes de séquençage NGS de phages sont disponibles pour référence.Séquençage de nouvelle génération pour l'analyse des phages : une approche moderne.

Les gens demandent aussi

Qu'est-ce que les bibliothèques de phages display ?

Les bibliothèques de phages affichés sont des collections de phages génétiquement modifiés (virus qui infectent les bactéries) qui affichent une large gamme de peptides, de protéines ou d'autres molécules à leur surface.

Quels sont les différents types d'affichage de phages ?

L'affichage de phages a plusieurs types, y compris l'affichage de peptides, l'affichage de protéines et l'affichage d'anticorps (comme scFv et Fab), qui sont utilisés pour dépister différentes molécules et anticorps, respectivement.

Qu'est-ce que le panoramique de bibliothèque ?

Dans sa forme la plus simple, le panning est réalisé en incubant une bibliothèque de peptides affichés sur phages avec une plaque (ou une perle) recouverte de la cible, en lavant les phages non liés et en élutant les phages spécifiquement liés.

Références:

1. Sloth AB, Bakhshinejad B, Stavnsbjerg C, Rossing M, Kjaer A. "La profondeur de séquençage joue un rôle déterminant dans la caractérisation des bibliothèques de peptides par affichage phagique par NGS." Int J Mol Sci. 2023 Mar 11;24(6):5396. doi : 10.3390/ijms24065396
2. Georgieva Y, Konthur Z. "Conception et dépistage de bibliothèques cDNA par affichage de phages M13." Molécules2011 fév 17;16(2):1667-81. doi : 10.3390/molecules16021667
3. Plessers S, Van Deuren V, Lavigne R, Robben J. "Le séquençage à haut débit des bibliothèques d'affichage de phages révèle un enrichissement parasitaire des mutants Indel causé par un biais d'amplification." Int J Mol Sci. 24 mai 2021 ; 22(11) : 5513. doi : 10.3390/ijms22115513
4. Ledsgaard L, Ljungars A, Rimbault C, Sørensen CV, Tulika T, Wade J, Wouters Y, McCafferty J, Laustsen AH. "Avancées dans la technologie d'affichage des phages d'anticorps." Découverte de Médicaments Aujourd'hui. Août 2022 ; 27(8) : 2151-2169. doi : 10.1016/j.drudis.2022.05.002
5. Kamstrup Sell D, Sinkjaer AW, Bakhshinejad B, Kjaer A. "La capacité de propagation des bibliothèques de peptides affichés par phage est affectée par la longueur et la conformation du peptide affiché." Molécules2023 Jul 10;28(14):5318. doi: 10.3390/molecules28145318
6. Lindner T, Kolmar H, Haberkorn U, Mier W. "Bibliothèques d'ADN pour la construction de bibliothèques de phages : exigences statistiques et structurelles et méthodes synthétiques." Molécules2011 févr. 15;16(2):1625-41. doi : 10.3390/molecules16021625
7. Tsoumpeli MT, Gray A, Parsons AL, Spiliotopoulos A, Owen JP, Bishop K, Maddison BC, Gough KC. "Une méthode simple de PCR sur plasmide entier pour construire des bibliothèques de phages de synthèse à haute diversité." Mol Biotechnol. Juil 2022;64(7):791-803. doi : 10.1007/s12033-021-00442-4
8. Nannini F, Senicar L, Parekh F, Kong KJ, Kinna A, Bughda R, Sillibourne J, Hu X, Ma B, Bai Y, Ferrari M, Pule MA, Onuoha SC. "Combinaison de l'affichage de phages avec le séquençage de nouvelle génération SMRTbell pour la découverte rapide de fragments scFv fonctionnels." AcMabs. 2021 Jan-Déc;13(1):1864084. doi : 10.1080/19420862.2020.1864084